Guy Pène du Bois nació en Brooklyn, Nueva York, el 4 de enero de 1884. Empezó a estudiar en la New York School of Art en 1899 y todavía seguía allí cuando Robert Henri ingresó como profesor en 1902. En 1905 Du Bois viajó a París con su padre y allí estudió en la Académie Colarossi con Steinlen. Cuando en 1906 Du Bois regresó a Nueva York, trabajó como periodista en el New York American. En 1909 ascendió a crítico de arte, puesto que desempeñó hasta 1912. En 1911 se casó con Florence Sherman Duncan y en 1913 nació su hija Yvonne. Du Bois fue miembro de la comisión de publicidad de la Armory Show de 1913 y ese mismo año empezó a trabajar como ayudante de Royal Cortissoz en el New York Tribune. La carrera de Du Bois como crítico de arte se desarrolló en paralelo a su carrera como artista y en 1913 empezó a exponer en la Kraushaar Gallery. De 1914 a 1917 los Du Bois vivieron en Nutley, Nueva Jersey. En 1916, el mismo año en que Du Bois empezó a trabajar en el New York Post, nació su hijo William. En 1917 el pintor expuso en la Whitney Studio y al año siguiente celebró una exposición individual en esa misma galería. Du Bois empezó a dar clases, primero en la Art Students League y luego en su propio estudio. La familia Du Bois se trasladó a Connecticut en 1920 y de allí a Francia en 1924. En 1930 regresaron a Estados Unidos y Du Bois volvió a dar clases. Enseñó durante un año en la Art Students League y en 1932 abrió su propia academia, la Guy Pène du Bois School. A finales de la década de 1930 impartió sus enseñanzas en la Amgansett Art School, Long Island, y en la Cooper Union School of Art. A Du Bois se le concedieron numerosos premios y distinciones en la década de 1940. En 1951 colaboró con Raphael Soyer en Reality: A Journal of Artists's Opinions. Visitó por última vez París con su hija Yvonne en 1953 y murió en Boston, Massachusetts, el 18 de julio de 1958.